近日，中國科學(xué)院武漢植物園萬濤和王青鋒研究員團隊在百歲蘭（Welwitschia mirabilis）葉片衰老的調(diào)控機制研究方面取得了新進展。相關(guān)研究成果已經(jīng)發(fā)表在國際權(quán)威期刊《Plant Biotechnology Journal》（IF=10.5、一區(qū)top期刊）上。

百歲蘭是一種古老的裸子植物，以其僅有的兩片葉片可存活千年而聞名，且能適應(yīng)極端干旱的納米布沙漠環(huán)境。目前，針對其葉片抗旱機制的研究已有較多積累，但關(guān)于葉片衰老的內(nèi)在調(diào)控機理，人們?nèi)运跎佟１M管針對其葉片抗旱機制的研究較多，但對葉片衰老的內(nèi)在調(diào)控機理所知甚少。不同于典型植物葉片從尖端向基部衰老的模式，百歲蘭的衰老局限于葉尖（S6區(qū)域），其余部分保持綠色，暗示獨特的程序化衰老途徑。生理分析顯示，衰老區(qū)域（S6）的脫落酸（ABA）含量顯著升高，電解質(zhì)滲漏率增加，葉綠素含量下降。分子層面，ABA生物合成關(guān)鍵基因（WmNCED6、WmNCED9）、衰老相關(guān)基因（WmSEN1、WmSEN2）及葉綠素降解基因（WmPAO1-1、WmPAO2-1）在S6區(qū)表達上調(diào)，表明ABA積累是驅(qū)動衰老的核心因素。

先前研究提出，葉片持續(xù)生長由KNOX-PHAN基因模塊調(diào)控，但衰老的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不明確。ABA作為葉片衰老的核心激素，其合成與信號通路在百歲蘭中尚未深入探索。該研究通過篩選衰老誘導(dǎo)的啟動子順式元件，發(fā)現(xiàn)MYB結(jié)合位點（MBS）高頻率出現(xiàn)在ABA合成基因（WmNCEDs）的啟動子中，進而鎖定R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子WmMYB111。該基因表達受ABA誘導(dǎo)且與衰老進程同步，暗示其核心調(diào)控作用。進一步研究表明，ABA信號通路的關(guān)鍵因子WmABF1-1（ABF家族成員）能直接激活WmMYB111，形成WmABF1-1-WmMYB111調(diào)控模塊，通過級聯(lián)放大ABA信號并整合葉綠素降解與氮（N）轉(zhuǎn)運過程（圖1）。

此外，葉片衰老過程伴隨氮的再分配，衰老區(qū)域的氮含量顯著降低而氮轉(zhuǎn)運基因（WmNRT1.7a、WmNRT2.5）被激活。低氮條件加速衰老，高氮則延緩，證實衰老與營養(yǎng)回收的緊密關(guān)聯(lián)。WmABF1-1與WmMYB111能直接激活WmNRTs啟動子，表明該模塊通過協(xié)調(diào)ABA積累、葉綠素降解和氮轉(zhuǎn)運，實現(xiàn)衰老過程的資源優(yōu)化利用。

圖1. WmABF 1 - 1 WmMYB 111模塊控制的百歲蘭葉片衰老和氮素運輸調(diào)節(jié)模型

圖2 . ABA合成基因WmNCED6和WmNCED9對葉片衰老的調(diào)控作用

為了驗證百歲蘭ABA合成基因WmNCED6和WmNCED9是否具有驅(qū)動衰老的功能。研究者通過在擬南芥（Col-0野生型背景）中過表達這兩個基因（獲得轉(zhuǎn)基因株系WmNCED6-OE#1,2與WmNCED9-OE#1,2），檢測第三、第四蓮座葉的衰老表型，并利用廣州博鷺騰生物科技有限公司PlantView230F調(diào)制葉綠素?zé)晒饣铙w成像系統(tǒng)檢測光合效率（Fv/Fm）（圖2）。結(jié)果顯示：與野生型相比，所有過表達株系葉片均表現(xiàn)顯著加速衰老——葉片大面積黃化萎蔫（視覺表型），同時其Fv/Fm比值（光合作用核心指標(biāo)）急劇下降，平均值從野生型的0.78 ± 0.02降至0.53 ± 0.03（p < 0.01），表明葉綠素降解導(dǎo)致光合功能嚴(yán)重受損。

                   圖3 . 轉(zhuǎn)錄因子WmMYB111對葉片衰老的調(diào)控作用                                圖4 . ABA信號因子WmABF1-1和轉(zhuǎn)錄因子WmMYB111對葉片衰老的調(diào)控作用

類似地，為驗證百歲蘭轉(zhuǎn)錄因子WmMYB111對衰老的調(diào)控作用，通過分析擬南芥野生型（Col-0）與過表達株系（WmMYB111-OE#1,2）第三、第四蓮座葉的衰老表型及Fv/Fm比值（圖3）。結(jié)果顯示：過表達WmMYB111的轉(zhuǎn)基因植株葉片顯著延緩衰老——相較于野生型葉片明顯黃化萎蔫，轉(zhuǎn)基因株系葉片維持綠色狀態(tài)更久，且其光合功能關(guān)鍵指標(biāo)Fv/Fm比值顯著高于對照組（數(shù)據(jù)基于多個生物學(xué)重復(fù)）。

為驗證 WmABF1-1在百歲蘭葉片衰老中的功能，采用TRV介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)構(gòu)建 WmABF1-1 敲低株系（TRV-WmABF1-1）與空載體對照（TRV-control），觀測離體葉盤在20天內(nèi)的衰老進程（圖4）。結(jié)果顯示：沉默WmABF1-1顯著延緩衰老——TRV-control葉盤在第15天明顯黃化萎蔫（黃化面積＞80%），而TRV-WmABF1-1葉盤至第20天仍保持＞60%綠色面積；同步進行的葉綠素?zé)晒庑剩‵v/Fm）測定進一步證實，TRV-control的Fv/Fm值從初始0.82±0.03持續(xù)降至第20天0.35±0.05（降幅57.3%），而沉默組同期僅降至0.68±0.04（降幅17.1%，P < 0.001）。該結(jié)果直接證明 WmABF1-1通過促進葉綠素降解與細(xì)胞解體程序正向調(diào)控衰老。

在ABA缺陷突變體aba1-5的衰老葉段中，通過瞬時表達ABA信號因子WmABF1-1和衰老抑制因子WmMYB111，分析第10天局部區(qū)域表型、光合效率（Fv/Fm）（圖4）。結(jié)果表明：WmMYB111過表達能顯著延緩衰老——處理區(qū)域葉片的黃化程度明顯減輕，其Fv/Fm值顯著高于對照組（達基部水平），直接證實WmMYB111具有抑制衰老程序執(zhí)行的功能；而WmABF1-1過表達則加速衰老，導(dǎo)致Fv/Fm值下降，葉片萎蔫加劇。

圖5. 煙草葉片雙熒光素酶實驗

另外，為明確WmMYB111轉(zhuǎn)錄因子對其靶基因啟動子的激活能力，WmABF1-1對百歲蘭衰老核心基因的調(diào)控功能，以及WmABF1-1與WmMYB111對百歲蘭氮轉(zhuǎn)運基因（WmNRT1.7a與WmNRT2.5）的調(diào)控機制。在本氏煙草葉片中進行雙熒光素酶實驗（圖5）。利用廣州博鷺騰生物科技有限公司PlantView植物活體成像系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)：WmMYB111顯著增強所有其靶基因啟動子的活性；WmABF1-1對三類啟動子均具有顯著激活作用；WmMYB111顯著激活所有氮轉(zhuǎn)運基因啟動子片段活性，WmABF1-1則強烈抑制氮轉(zhuǎn)運基因上述啟動子。

以上結(jié)果證明過表達WmNCED6/9可通過促進ABA合成，在模式植物中直接觸發(fā)早衰，不僅驗證了二者在百歲蘭葉尖衰老中的核心作用，也為"ABA積累→衰老執(zhí)行"通路提供了跨物種功能證據(jù)。

WmMYB111作為衰老負(fù)調(diào)控因子，能夠有效抑制葉綠素降解并維持光合機構(gòu)完整性，從而延遲衰老進程，同時也揭示其作為ABA通路下游的核心衰老負(fù)調(diào)控因子，通過獨立于ABA的方式維持光合功能與營養(yǎng)滯留。

論文鏈接：https://doi.org/10.1111/pbi.70290